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解鎖單細胞小RNA測序新“姿勢”
 Pippin Prep助力單細胞小RNA測序

Small RNA是一類長度在20~30nt的RNA分子,Small RNA種類較多,研究比較成熟的主要有siRNA(小干擾RNA)和microRNA(微小RNA)。還有其他一些種類的小RNA,如piRNA(蛋白互作小RNA),snRNA(小核RNA),snoRNA(核仁小RNA)等。Small RNA能夠調控基因的表達,在細胞的生長、發育、代謝等基礎生物學過程中扮演著重要的角色,甚至在癌癥等相關疾病形成過程中起著關鍵的作用。小RNA測序鑒定和定量解析已知的小RNA,并預測新的小RNA及預測小RNA的靶基因,是研究小RNA的功能和調控機制的有力工具。

Michael Hagemann-Jensen, et.al于2018年9月在《Nature Protocols》上發表的文章(原文鏈接:https://doi.org/10.1038/s41596-018-0049-y)中提出了異于傳統小RNA測序的單細胞小RNA測序技術—Small-seq技術。Small-seq技術是指對單個細胞的小RNA進行測序,是一種基于接頭反應,集捕獲、測序以及小RNA分子定量分析于一體的對單個哺乳動物細胞進行測序的方法。該方法的大致流程如下:

 
其中步驟11提到的片段選擇,是Small-seq技術非常推薦的一個步驟,該步驟不僅可以富集所需要的目標片段,同時還可以高效地去除引物二聚體等影響后續測序實驗的非靶向片段。該步驟推薦使用Sage Science公司的PippinPrep進行片段選擇。其具體實驗設計如下:
(一)實驗材料:制備好的小RNA文庫
(二)實驗試劑:
Pippingel cassette,3% agarose(Sage Science, cat. no. PIP0001)
Pippin Prep Reagent Kit for 3% gel cassettes (Sage Science, cat. no. CSD3010)
(三)實驗儀器:PippinPrep(Sage Science)
(四)實驗步驟:
1. 片段選擇參數設置:選擇“3%DF Marker P”,選擇“Tight”純化模式,起始
和終止片段大小分別設置為130bp和160bp。
2. 從小RNA文庫中吸取30ul的DNA與10ul的DNA Marker P 振蕩混勻。
3. 上樣:將40ul混合液加至3%的預制膠板上樣孔中。
4. 運行程序。程序結束后,從洗提孔中吸出40ul 回收產物。
5. 取1ul 回收產物用Agilent 2100 進行片段分布分析。
Note:整個過程用時約2小時,手工操作時間僅5min。
(五)實驗結果


Pippin Prep對文庫進行片段選擇后峰圖
(片段回收范圍:130-160bp
 

由上圖可知,PippinPrep在small RNA測序過程中,可以對構建好的小RNA文庫進行純化,可減少實驗過程中引入的引物二聚體,更有利于下一步的測序實驗。使用PippinPrep進行片段回收,不僅操作簡單、耗時短,而且回收范圍窄,所獲得的目標片段純度更高。

美國Sage Science公司推出的全自動片段回收類產品除了PippinPrep,還有分離片段大小和通量不同的其他型號,其中Blue Pippin、PippinHT都可以對構建好的小RNA文庫進行純化。

有關Sage Science
美國Sage Science公司位于美國馬塞諸塞州Beverly市,專注于核酸和蛋白領域的樣品制備。Pippin系列核酸片段自動回收設備已成為測序實驗室標準配置,并享有產品和技術專利。現已開發出五款產品:Pippinn Prep、Blue Pippin、Sage ELF、PippinHT、Sage HLS,滿足不同類別的客戶需求,廣受市場歡迎。

Pippin系列基于先進的技術原理進行DNA片段回收:Pippin系統包括一次性的5泳道預制膠電泳槽,一個帶有DNA熒光檢測光路單元(非紫外)的電泳平臺。運行中,軟件通過實時光路檢測,和參考泳道中的DNA ladder進行比對,確定已經設置回收長度范圍的DNA片段到達洗提泳道(elution channel)的準確時間。通過電極切換,打開洗提泳道,使目標片段進入洗提泳道的回收室中,從而實現回收。然后電極再次切換,洗提泳道關閉,剩余的DNA分子進入原先的分離泳道(separation channel)。
 
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